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制备单细胞悬液于 200μl 的 PBS 缓冲液中；
加入 2ml 预冷的 70%乙醇，4℃保存；

组织病理技术组织处理：1.取新鲜组织厚度不超过 5mm，10% 中性福尔马林固定，大于 24 小时。2.固定后冲水 12-24 小时，3.75%酒精，1 次，1 小时，4.85%酒精，1 次，1 小时，5.95%酒精，3 次，1 小时

一、目的基因的克隆（以pshuttl-CMV质粒为例）1.选择适当酶切位点，进行酶切连接，将目的片段插入 pshuttl-CMV 质粒多克隆位点。

ELISPOT1.PBS 溶解抗原为 30 μg/ml，加 100 μl/孔于 PVDF 膜铺底的 96 孔灭菌板过夜；2. 第二天吸去包被液后，加 5％FCS 的 PRMI 1640 培养基 100 μl 封闭 1 小时，37 oC；3. 准备脾

1.将 E.coli /phage lysate 以 1:10-20 稀释在 TBST 溶液中。
2.将 4 张 82mm 的 nitrocellulose membranes（NC）浸入稀释后的 E.coli/ phage
lysate 中，室温下水平摇动 30 分钟，取出 NC 并使膜沥干。
3.用 50ml TBST 溶液洗膜 3 次，每次 10 分钟。

血清制备
1.取血后，37oC 下，让血液凝固 1 到 2 小时（不加抗凝剂）；
2.4oC 冰箱过夜（让血块固缩）；
3.当血清自然析出后， 4oC，3000 转/分，离心 10 分钟，分离血清，弃去

确定抗生素作用的最佳浓度

该操作以 Invitrogen 公司的脂质体转染试剂 LipofectAMINE 为例，其它转染试剂可参照各自的使用说明书进行。

重组子可通过酶切进行鉴定，也可以利用扩增引物通过 PCR 进行鉴定，阳性重组子能切出所需要的片段或得到相应片段的 PCR 产物

取 100ul感受态细胞于冰浴上融化

挑取适当菌株的 E.coli 单菌落接种于 2ml SOB 培养液中，37℃摇床过夜

连接前先电泳确定待连接载体与片段的浓度