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用 PBS 或碳酸盐缓冲液稀释抗原至终浓度 20μg/ml。用吸管吸取 50μl 稀释抗原到 PVC 微孔板上，按要求往后进行系列稀释。

通常将未知浓度样品与阳性对照标准曲线相比较，可精确定量。每块板都要带标准（做平行或者三份）和空白对照以保证精确性。

用鼠抗体对鼠组织染色是个复杂的过程，因为容易导致背景染色高，而且很难消除。 形成这种背景主要是由于组织染色时二抗与内源性的鼠 IgG，或 B 细胞、浆细胞及巨噬细胞上的 Fc 受体结合造成的。

出于多种考虑，将小组织片段简单浸泡在固定液中便能得到合适的固定，对大多数组织来说可能是唯一的固定模式。然而更快、更均一的固 定方法是将固定液通过管道系统如心主动脉或腹部主动脉灌注到组织中。下面介绍一下用 4% 多聚甲醛固定大鼠大多数器官的操作步骤。

固定就是保持抗原细胞和亚细胞结构固定不动，同时又能使抗体进入到细胞和亚细胞的所有部位。固定和通透方法的选择取决于抗原表位和 抗体本身的灵敏性，有时需要优化。

关于免疫组织化学内容，今天要介绍的是冷冻切片切割技术和免疫细胞化学 (ICC) 指南的具体步骤。

免疫组织化学 (IHC) 是确定组织切片上蛋白的存在与否及存在位置的一种方法。尽管这种方法在定量分析时灵敏度较免疫印迹法或 ELISA 等 免疫测定方法低，但是它能观察到整个组织的情况。适用于评估癌症等疾病的发展及治疗情况。

无信号:一抗和二抗不匹配,二抗需和一抗宿主的物种相同（如一抗来自兔，二抗为抗兔抗体）。没有足够的一抗或二抗结合目标蛋白

蛋白显色的阶段非常重要，可以知道蛋白迁移的是否均匀、平坦。如果分离后的蛋白需要转膜，就用铜染，因为考马斯蓝染色是不可逆的。 考马斯蓝染色只用来检测转移的有效性，或者蛋白不需要转膜时，只用于观测蛋白 SDS-PAGE 分离的结果。

电泳可以是单相的（即一维分离）也可以是双相的。单相电泳常用来进行蛋白和核酸的分离，蛋白的双相电泳用于指纹-识别（即总蛋白成分分析）和细胞里所有蛋白的精确定位。这里我们所描述的是单相电泳技术。

准备凝胶电泳的样品，需要对细胞和组织进行裂解以释放目的蛋白，这些可溶性蛋白能够穿过分离胶单独移动。裂解缓冲液有很多种，但用 来做 WB试验的仅有少数几种。简单来说，它们溶解蛋白的能力不同，含有十二烷基硫酸钠和其他离子型去污剂的溶解能力最强。

由于其独特的电子构型，荧光物具有典型的吸收（激发）和发射光谱。

单一染色在特定波长被激发，在另外一个波长发射光子。

复合染色由距离非常近的、能量可以在彼此之间传递的一个供体及一个受体荧光物分子所组成。复合染色在受体分子的激发波长

被激发，在 供体分子的发射波长发射一个光子