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没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以 了；也可能母液（30%聚丙酰胺）有问题，你可以重新配制一份观察；能够替换的试剂，尽量换一 下，选用好的试剂。

无特殊要求。但我们一般是上槽放新鲜的缓冲液，下槽可以是重复使用过一两次的缓冲液。

这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是否能做 WesternBlot 和免疫组化。

一抗的稀释度是有说明的，根据你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育体积一般最少为3－ 5ml

这是正常的，大分子的蛋白转移的慢，你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分 子的就有可能会变淡。

可以。

PVDF 膜用甲醇泡的目的是为了活化 PVDF 膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结 合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属 于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间 结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位， 那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。

对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP 标记的二抗。

抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3 次。稀释 后应在 2－3 天内使用，4 度保存，避免反复冻融。

比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异的本底。

上样量要根据实验的要求来定， 如果要求是定量和半定量的WesternBlot 则上样量要均等，如 果只是要定性，则没有太大的关系，尽量多上就行了，但是不要超载。