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常见问题
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  • Jackson冻干粉抗体溶解保存方法


    储存:冻干粉原装储存在 2-8℃(不开封原装保存 3-5 年)。

    溶解:加入一定体积 dH2O(参考特定说明书),溶解完全。工作液现用现配。

    保存:

    (短期保存)未稀释的液体,在 2-8℃下稳定约 6 周;

    (长期保存)

    方法一、水化后分装,置于-70°C 或以下冷冻保存,避免重复冻融。

    方法二、添加等体积的甘油(ACS 级或更高),终浓度变为原来的 50%,以液体形式储存于-20℃。


    注意:加入甘油后使蛋白质浓度和稀释的范围都减半(比如:重溶后抗体的浓度是 0.8mg/ml,

    体积 2ml,抗体稀释比例 1:5,000 - 1:100,000 for WB, 加入等体积(2ml)的甘油后, 抗体浓

    度变成 0.4mg/ml,体积 4ml,抗体稀释比例变成 1:2500-1:50000 for WB)。


    水化后保质期:自补水之日起一年。如果测试结果符合预期用途,则可以延长有效期


  • ProSpec 细胞因子和重组蛋白溶解

    我们知道,ProSpec 相当一部分细胞因子和蛋白为冻干粉,这使得运输非常便捷,只要常温即可。而且,细胞因子和蛋白 冻干粉非常稳定,在-20-80条件下可保存数年。冻干粉在使用前需进行溶解,然后以液体形式加到培养体系。溶解步骤非 常关键,因溶解不好会导致细胞因子或蛋白的失活,这也是很多用户在实际使用中经常遇到的问题。

    那么,应该如何进行正确的溶解呢? 

    下面我们以 Recombinant Human IL-4 (重组人 IL-4,产品编号:CYT-211)的说明书为例,对细胞因子或蛋白的溶解方法 进行详细的阐述。 

    拿到重组人 IL-4 的说明书后,您会发现有一段关于 Reconstitution(重悬)的叙述,这段内容含有溶解相关的所有信息。


    1. Centrifuge the vial prior to opening  

    1 步:开盖前离心试剂管 

    ProSpec 的细胞因子或蛋白冻干粉装盛在塑料管中,为无菌包装。冻干粉在运输过程中可能会因颠簸而漂散并粘贴于管壁 或管盖上,所以在打开塑料瓶盖前,需将冻干粉通过离心收集到管底,以便用很小体积的液体即可将冻干粉完全溶解。 

    有很多用户会问一个问题,即应该用多少转速、多长时间离心试剂管,才能达到良好的收集效果? 

    答:有些小型高速离心机(多为进口品牌)的面板上有一个 Spin 键,按了此键后,离心机会自动快速上升到其最大速度 (10000rpm 12000rpm),上升到最高点后速度即刻下降,直至停止旋转,整个过程大约 30s。这个 Spin 键足以很好的将细 胞因子或蛋白收集到管底。但有些实验室没有这样的高速离心机,只有最高转速为 4000-4500rpm 的离心机。这种情况下,需 3000-3500rpm 离心 5min,也能达到类似的效果。


    2. Reconstitute in water to a concentration of 0.1-1.0 mg/ml. Do notvortex. 

    2 步:用无菌水重悬至 0.1-1.0 mg/ml,不可振荡。 

    这个步骤即为溶解步骤,非常重要。 

    1) 一定要用推荐的溶液重悬(或溶解)冻干粉 

    用于溶解细胞因子或蛋白的溶液千差万别。此例中的重组人 IL-4 需用水溶解,而重组人 IL-2 (产品编号:CYT-209)则需用 20mM Acetic Acid (醋酸)溶解,重组人 TGF-beta1(产品编号:CYT-716)需用 10mMAcetic Acid (醋酸)溶解 (注:即使同一 重组细胞因子或蛋白,不同批次的溶解方法也可能有所不同,因此上面的叙述仅供参考。具体应该如何溶解应以相应批次的官方 说明书为准)。后续的文章中将对各种溶解液的配制方法进行详细的阐述,望继续关注。 

    经常有用户会问,为什么会有这么多种溶解方法? 

    答:我们知道,蛋白的溶解性与很多因素有关,其中比较重要的是 pH 值和离子强度。ProSpec 的细胞因子或重组蛋白在 出厂前均经严格测试,说明上所标明的溶解液是能够将该细胞因子或重组蛋白完全溶解的液体。如果您所用的溶解液的 pH 值和 离子强度与说明书中所标明的不符,很多时候会造成细胞因子或重组蛋白不能完全溶解或者根本无法溶解,这样所配得的细胞因 子或重组蛋白必然活性不够或丧失。 

    有不少用户没注意说明书上的描述,而是根据习惯,直接用 PBS 或培养液(1640 或 DMEM 等)等溶解细胞因子或蛋白的 冻干粉。这样做可以吗?

    答:有时可以,要看具体情况。ProSpec 的大多数细胞因子或蛋白冻干粉的溶解液不是 PBS,此时千万不能用 PBS 或培 养液直接来溶解,具体原因在上面已经叙述过。而有部分细胞因子,如重组人 KGF 和重组人 FGF-23 等,说明书上的溶解液即为 1x PBS,此时用 PBS 溶解完全没问题,那么用培养液溶解也是可以的,不过最好还是用先用 PBS 溶解,然后再用培养液稀释。 

    2) 一定要溶解到指定的浓度。 蛋白在一定的浓度范围内可以保持良好的稳定性,这个范围就是说明书上所标明的浓度范围,该例为 0.1-1.0mg/ml这个浓度范围对于不同的细胞因子或重组蛋白是不同的。 

    高于或低于该浓度范围会有什么问题呢? 

    答:首先,细胞因子或蛋白会不稳定,即很容易出现活性下降的现象。其次,高于这个浓度范围,可能会超过该蛋白的 最大溶解浓度,即蛋白无法完全溶解。再者,高于或低于该浓度范围,蛋白可能会出现聚集(aggregation),最终结果还是部分 蛋白未溶解,导致蛋白活性的减弱。 

    3) 一定不能振荡(vortex)。 

    这里所说的振荡是指用涡旋仪进行快速振荡。 

    有用户会问,若想保证溶解液与冻干粉充分混匀,以实现细胞因子或重组蛋白的完全溶解,该怎么办呢?

    答:多数细胞因子或重组蛋白的冻干粉是非常容易溶解的,一般我们用移液枪的枪头轻吹几下,即可使细胞因子或重组 蛋白完全溶解。 

    对于不易溶解的细胞因子或蛋白,ProSpec 会在说明书中进行备注。这种情况下,您最好能将要溶解的细胞因子或重组 蛋白放在水平摇床(shaker)上低速摇一段时间,促使细胞因子或重组蛋白完全溶解。 


    3. This solution can be stored at 2-8for up to 1week. 

    3 步:该重悬液在 2-8最长可保存 1 周。 

    用说明书上推荐的溶液将细胞因子或重组蛋白重悬到推荐的浓度后,细胞因子或重组蛋白可放置在 2-8,即冰箱的冷藏室。 在这种条件下,细胞因子或重组蛋白的活性最长可保持 1 周。这对一个周期为 5-7 天的实验,如 DC(树突状细胞)的诱导成熟是 足够的。在此期间,只要每次从冰箱里吸取一定量的细胞因子或重组蛋白溶液加入到培养体系内即可。 

    其实,说明书上推荐的浓度对于一般的实验来讲是比较高的。所以用户通常会将该溶液进一步稀释后再放在 4保存,待 1 周内用完。如进行稀释,必须遵照下面第 4 步的方法,即需用含载体蛋白的溶液进行稀释,否则稀释后的细胞因子或重组蛋白很 容易会粘附在管壁或瓶壁上,使得溶液中的细胞因子或重组蛋白的浓度下降,细胞因子或重组蛋白的总活性则大为减弱。


    4. For extended storage, it is recommended to further dilute in abuffer containing a carrier protein (example 0.1%  BSA) and store in workingaliquots at -20to -80

    4 步:如要长期保存,则需用含载体蛋白(0.1% BSA,或 10% FBS,或 5% HSA)的溶液进一步稀释,然后分装冻存于-20-80。 

    如果一个实验周期长于一周,或配制的细胞因子或重组蛋白一次用不完,我们就需对细胞因子或重组蛋白进行长期保存。 方法是:将已重悬的细胞因子或蛋白用含载体蛋白,如 0.1%BSA(牛血清白蛋白)10% FBS(胎牛血清)5% HSA(人血清白蛋白) 的溶液将重悬液进一步稀释,然后分装冻存于-20-80,即常规冰箱的冷冻室或超低温冰箱中。 

    经常有人会在细胞因子或重组蛋白冻干粉用推荐的溶液重悬后直接分装冻存于-20至-80,这样可以吗? 

    答:不行。我们知道,塑料管壁对多数蛋白均有很好的吸附作用,也就是说溶液中的蛋白很容易粘附在管壁。粘附后, 蛋白是很难与管壁分离的。做过 ELISA 实验的人都知道,ELISA 的包被抗体(Capture antibody)就是通过这种粘附作用包被到酶 标板上的。 

    载体蛋白,如 1% BSA10% FBS(胎牛血清)5% HSA 等的主要作用是预先封闭塑料管壁上的蛋白结合位点,使细胞因子 或重组蛋白不会粘附于管壁。如果在细胞因子或重组蛋白冻干粉用推荐的溶液重悬后不用含载体蛋白的溶液进一步稀释,而直接 分装冻存,则溶液中的大部分细胞因子或重组蛋白均会粘附到管壁上,导致溶液中实际溶解的细胞因子或重组蛋白的浓度大为降 低,最终表现为细胞因子或重组蛋白活性的下降。 

    因此,在分装冻存前,一定要用含载体蛋白的溶液将重悬液进一步稀释。稀释后的细胞因子或重组蛋白可为任意浓度,因大 量的载体蛋白可以保证低浓度细胞因子或重组蛋白仍然维持较高的稳定性。 

    那么,含载体蛋白的溶液指的是什么溶液呢?水可以吗? 

    答:水不可。该溶液通常是指 pH 近中性,有一定缓冲能力的缓冲液,如 PBS,培养液(RPMI1640, DMEM )等。 

    还有一个经常被问及的问题,即在做无血清培养或动物的体内实验时,细胞因子中不能含有 BSA,FBS 或 HSA 等动物或 人的蛋白,要想长期保存细胞因子或重组蛋白该怎么办呢? 

    答:一种方法是订购 ProSpec 的小包装细胞因子或重组蛋白,每次使用一只,用后即废弃。


    5. 后续稀释液的配方:即原产品的溶液的配方。 

    总之,为保证细胞因子或重组蛋白冻干份在重悬后仍能保持良好的生物活性,必须按照说明书中 Reconstitution 的方法 严格操作。 

    蛋白有价,实验无价,愿大家珍惜每次实验机会,严谨认真,每次均能得到预期的实验结果!


  • 如何确定细胞因子的种属交叉活性?

    1) 除少数例外,大多数人类细胞因子对小鼠细胞均有活性。

    2) 许多小鼠细胞因子也可作用于人类细胞,但比活性可能低 于对应的人类细胞因子。 

    3) IL-7 等为数不多的人类细胞因子作用于小鼠细胞时比对应的小鼠细胞因子活性更强。

    4) 干扰素, GM-CSF, IL-3 IL-4 等细胞因子种属特异,对非同源细胞几乎没有活性。

    5) 相反,成纤维细胞生长因子(FGFs)和神经营养素 (neurotrophins)高度保守,在不同动物种属细胞上均具有很好的活性。

  • ED50 和 units/mg 之间有何关联?

    ED50 为半数有效浓度,其定义是可诱导 50%最大反应的细胞因子浓度,这种活性表示法仅适用于剂量反应曲线呈 S 的细胞因子。其实,可以将 ED50 的值接理解为 1unit。如某种细胞因子或蛋白的 ED50 1ng/ml,那么 1ng/ml 即可看作是 1unit那么我们也不难理解,1mg(1x106ng) 该细胞因子或蛋白中应含 1x106/1= 106units. ED50(ng/ml)转化为 units/mg 的公式如下:

    image.png

  • 为什么有时在管中看不到细胞因子或蛋白的冻干粉?

    与市场上的许多蛋白产品不同,ProSpec 的产品中均不含载体蛋白或其它添加物(如牛血清白蛋白(BSA),人血清白蛋白 (HSA)和蔗糖等,并且是以最低含盐量的溶液进行冻干的,因此冻干后常常不能形成白色网架结构,而是微量的蛋白在冻干过程 中沉积在管内,形成很薄或肉眼不可见的透明蛋白层。打开管盖前,我们建议您在小离心机中快速离心 20-30 秒,使附着在管盖 或管壁上的蛋白聚集于管底。我们的质控步骤保证每管中所含的蛋白量准确无误,虽然有时您无法看到蛋白粉末,但管中的蛋白 含量仍是非常精确的。

  • ProSpec 细胞因子和蛋白产品的稳定性如何?

    除非在产品说明书中特别注明,ProSpec 相当一部分产品为冻干粉,它们在室温条件下非常稳定(至少 1 个月)。尽管如 此,我们还是建议您在收到我们的产品后保存于-20℃,以确保蛋白 100%的活性。对于大多数蛋白,重悬后在 4℃仅能短期保存 (1 )。如想长期保存,请先配制成稀释液(其中必须含有载体蛋白,如 0.1% BSA5%HSA,或 10% FBS),然后分装冻存于 -20℃-80℃。一定要避免反复冻融,因每次冻融均会引起蛋白的部分失活。

  • 如何确认同一个蛋白(产品替换)

    image.png

    1.找到这个抗体的免疫原,什么蛋白的抗体。【留意应用类型和反应种属】 或者,在【靶标】这一栏观察,SwissProt 这一栏,至于是选人的还是小鼠的, 根据客户实验需求来。可以点击进去,进入 Uniprot 数据库。

    image.png

    2. (Uniprot ID: P25054).这是数据库的 ID,类似身份证,打开数据库:http://www.uniprot.org/ ,输入 ID,P25054,搜索。

    3.

    image.png

    全名如图,可以用全名和缩写去搜索抗体。并在其它品牌的产品页面,留意观 察抗原的信息,是否与数据库的一致 ···这个 ID 相同,就像身份证号码一样,指示是同一个人。 

    案例:(问题,是否为同一个蛋白,是否可以替换为 Abbkine 产品) 

    1. http://www.alomone.com/p/anti-angiotensin-(1-7)_mas_receptor/agp-099/119 

    2. http://www.abbkine.com/product/mas1-polyclonal-antibody-abp57206/


  • 其它现象:

    ●膜上多处出现黑点或黑斑原因:抗体与封闭试剂发生非特异性的结合。 

    ●反白(条带显白色)原因:目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高。 

    ●蛋白分子量偏低或偏高原因:胶浓度不适合,高分子量要用低浓度胶;小分子蛋白要用高浓度胶。

  • Westernblot 结果中无信号或显示信号弱

    可能的原因及建议: 

    ●检测样本不表达目的蛋白选择表达量高的细胞作为阳性对照,用于确定检测样本是否为阴性。 

    ●检测样本低表达目的蛋白提高上样量,裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。 

    ●转移不完全或过转移可以用丽春红染膜并结合染胶(考马斯亮蓝)后确定条带是否转至膜上或转移过 头;适当调整转膜的时间和电流。 

    ●抗体不能识别测试种属的相关蛋白购买抗体前应当认真阅读抗体说明书,确定其是否能够交叉识别测 试种属的对应蛋白。 

    ●一抗孵育时间不足建议 4℃结合过夜。 

    ●二抗与一抗不匹配 选择针对一抗来源的种属的抗体。 

    ●洗膜过度洗膜时间不宜过长,加入的去垢剂不宜过强或过多,建议使用0.1%的弱去垢剂 Tween-20。

  • 安全问题:

    操作有毒试剂时,带手套和口罩,且操作挥发性试剂应在通风橱中进行。

  • Westernblot 结果中杂带较多

    可能的原因及建议: 

    ●目的蛋白有多个修饰位点(磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等),本身可以呈现多条 带。查阅文献或进行生物信息学分析,获得蛋白序列的修饰位点信息,通过去修饰确定蛋白实际大小。

    ●目的蛋白有其它剪切本查阅文献或生物信息学分析可能性。 

    ●样本处理过程中目的蛋白发生降解加入蛋白 酶抑制剂;样本处理时在冰上操作。 

    ●上样量过高,太敏感适当减少上样量。 

    ●一抗特异性不高重新选择或制备 高特异性的抗体。 

    ●一抗不纯纯化抗体 

    ●一抗或者二抗浓度偏高降低抗体浓度。

  • 电泳中常出现的一些现象:

    ●︶条带呈笑脸状 原因:凝胶不均匀冷却,中间冷却不好;电泳系统温度偏高。 

    ●︵条带呈皱眉状原因:可能是由于装置不合适,特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡,或者两边聚 合不完全。 

    ●拖尾原因:样品溶解不好。 

    ●纹理(纵向条纹)原因:样品中含有不溶性颗粒。 

    ●条带偏斜原因:电极不平衡或者加样 位置偏斜。

    ●条带两边扩散原因:加样量过多。

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